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抗菌的载药微球硅橡胶复合材料专利

专利号:201310415767.6

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专利名称:抗菌的载药微球硅橡胶复合材料

技术领域:抗菌,微球硅,橡胶,复合材料

IPC主分类号:C08L83/04

申请号:CN201310415767.6

公开日:2015-03-25

说明书

抗菌的载药微球硅橡胶复合材料

技术领域

[0001] 本发明涉及一种医用的硅橡胶复合材料,特别是涉及一种抗菌的载药微球硅橡胶复合材料。

背景技术

[0002] 硅橡胶材料是口腔颌面部手术后最常使用的赝复修复材料,硅橡胶材料的性能是影响修复最终效果的重要因素。目前,硅橡胶材料的性能尚存在许多不足。传统的硅橡胶材料经长期使用易导致病原微生物的滋生,造成感染。例如,金黄色葡萄球菌是引发口腔颌面赝复修复后感染的常见细菌之一。使用医用消毒剂可以杀灭硅橡胶材料上的金黄色葡萄球菌,但由于硅橡胶为有机高分子结构,经常浸泡消毒剂会加速硅橡胶老化,从而减少其使用寿命,这就使医生无法正常进行赝复体表面和内部的彻底消毒灭菌。
[0003] 随着材料学及医学领域的快速发展,传统的硅橡胶材料已经不能满足临床上口腔颌面赝复修复的要求,因此,功能性硅橡胶赝复材料的研究日益受到重视。开发出一种具有长效抑菌或灭菌作用,并可长时间保持上述性状稳定性的新型功能硅橡胶赝复材料是迫切需要解决的问题。

发明内容

[0004] 针对现有技术中存在的问题和缺陷,本发明目的在于提供一种具有长效抗菌作用的载药微球硅橡胶复合材料,克服了传统硅橡胶材料易感染细菌、使用寿命短等问题,可在口腔颌面赝复修复中广泛应用。
[0005] 本发明所述的抗菌的载药微球硅橡胶复合材料,包括:硅橡胶基质,为颌面赝复用硅橡胶基质;载药微球,为PLGA载药微球,与所述硅橡胶基质混合均匀;以及抗菌药物,负载于所述载药微球上。
[0006] 根据本发明所述的载药微球硅橡胶复合材料的进一步特征,所述的抗菌药物是抗需氧菌或抗厌氧菌的药物。
[0007] 本发明还提供了所述的载药微球硅橡胶复合材料的制备方法,包括以下步骤:
[0008] A.将抗菌药物和适宜载体材料置于有机溶剂中,溶解作为内油相;
[0009] B.将内油相与外水相混合,搅拌,离心,洗涤,冷冻干燥得到载药微球;
[0010] C.将稀释剂与颌面赝复用硅橡胶基质混合,降低硅橡胶粘度,获得第一混合物;
[0011] D.将步骤C所得的载药微球按比例加入所述第一混合物,并继续加入稀释剂,充分混合均匀,获得第二混合物;
[0012] E.将硅橡胶用固化剂加入所述第二混合物,充分混合均匀,获得第三混合物;
[0013] F.将所述第三混合物置入模具中,除气泡,固化,获得所述的载药微球硅橡胶复合材料。
[0014] 根据本发明所述的载药微球硅橡胶复合材料的进一步特征,所述步骤A中,所述药物为苯酰甲硝唑或者头孢呋辛钠;载体为聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA);有机溶剂为丙酮。
[0015] 根据本发明所述的载药微球硅橡胶复合材料的进一步特征,所述步骤B中,所述外水相为聚乙烯醇(PVA)溶液;离心方式为先混悬液800rpm×10分钟离心除去游离的药物,15000rpm×20分钟离心;洗涤方式为用去离子水洗涤三次。
[0016] 根据本发明所述的载药微球硅橡胶复合材料的进一步特征,所述混合为物理共混,所述除气泡为抽真空,所述固化为升温加速固化。
[0017] 根据本发明所述的载药微球硅橡胶复合材料的进一步特征,所述稀释剂为医用低粘度硅油。
[0018] 根据本发明所述的载药微球硅橡胶复合材料的进一步特征,所述步骤B中,还添加具有生物安全的溶剂,以提高微球的载药量。
[0019] 与传统硅橡胶材料相比,本发明所述的抗菌的载药微球硅橡胶复合材料具有以下优点:具有一定的抗菌活性,生物安全高,实现硅橡胶从无抗菌活性到具有抗菌活性的转变并实现抗菌药物的可控释放以达到长效抗菌,且仍能保持较高的拉伸强度、拉伸伸长率、撕裂强度、撕裂伸长率及适宜的硬度等优良性能,且能对硅橡胶的密度产生显著影响,能够降低硅橡胶的密度,减轻硅橡胶的质量,提高临床应用时的固位性,为扩大硅橡胶的临床应用范围提供了可能。本发明还摸索了制备所述的载药微球的最佳工艺:投药比为1:10,油/水为1:6,载体PLGA浓度为40mg/ml,PVA浓度2%。在此基础上,本发明提供了制备所述的抗菌的载药微球硅橡胶复合材料的最佳工艺。

附图说明

[0020] 图1为不同冻干保护剂作用下的苯酰甲硝唑PLGA载药微球产物,其中,A:甘露醇(2%)处理组;B:蔗糖(2%)处理组;C:葡萄糖(2%)处理组。
[0021] 图2为苯酰甲硝唑PLGA载药微球的电镜图(×400)。
[0022] 图3为苯酰甲硝唑PLGA载药微球的电镜图(×8000)。
[0023] 图4为苯酰甲硝唑硅橡胶复合材料样品,其中,A:空白组;B:0.2%苯酰甲硝唑组;C:0.4%苯酰甲硝唑组;D:0.8%苯酰甲硝唑组。
[0024] 图5为了苯酰甲硝唑硅橡胶复合材料样品,其中,A:1.2%苯酰甲硝唑组;B:10%苯酰甲硝唑载药微球组;C:20%苯酰甲硝唑载药微球组;D:20%苯酰甲硝唑载药微球组。
[0025] 图6为苯酰甲硝唑硅橡胶复合材料样品SEM表征,其中,A:空白组;B:0.2%苯酰甲硝唑组;C:0.4%苯酰甲硝唑组;D:0.8%苯酰甲硝唑组;E:1.2%苯酰甲硝唑组;F:10%苯酰甲硝唑载药微球组;G:20%苯酰甲硝唑载药微球组;H:30%苯酰甲硝唑载药微球组。
[0026] 图7为各组苯酰甲硝唑硅橡胶复合材料中药物体外释放图(n=3)。
[0027] 图8为拉伸性能测试样品模型示意图(单位:mm)。
[0028] 图9为撕裂强度测试样品模型示意图(单位:mm)。
[0029] 图10为邵氏硬度测试样品模型,采用聚四氟乙烯模具II,图中每格长70mm,宽40mm,厚6mm。
[0030] 图11为苯酰甲硝唑硅橡胶复合材料抗具核梭杆菌ATCC10953活性(I),其中,第一排右:空白组;第二排右:0.2%MEB组;第二排左:0.4%MEB组;第一排左0.8%MEB组;第一排中间1.2%MEB组。
[0031] 图12苯酰甲硝唑硅橡胶复合材料抗具核梭杆菌ATCC10953活性(II),其中,左:空白组;上:10%MEB-PLGA-NPs组;右:20%MEB-PLGA-NPs组;下:30%MEB-PLGA-NPs组。

具体实施方式

[0032] 实施例一:苯酰甲硝唑载药微球硅橡胶复合材料的制备与性能评价
[0033] 本实施例选择苯酰甲硝唑为抗菌药物,制备成苯酰甲硝唑载药微球硅橡胶复合材料,然后对该载药微球硅橡胶复合材料的抗菌活性、生物安全等进行初步评价,为苯酰甲硝唑载药微球硅橡胶复合材料的进一步应用提供依据。
[0034] 药物的选择:苯酰甲硝唑是硝基咪唑类抗菌药,具有无臭、无味、抗厌氧菌谱广的特点。本实验将苯酰甲硝唑制成载药微球,使其达到缓释长效地目的;另外本研究中将载药微球质轻、内部空间大的特点作为考虑因素,以期将载药微球填充到硅橡胶中达到减轻硅橡胶密度的效果,进而能够提高硅橡胶的固位性,更好地满足临床应用。因此,本实施例选用苯酰甲硝唑作为模型药物,制备成苯酰甲硝唑载药微球硅橡胶复合材料。
[0035] 口腔感染中的常见厌氧菌株有消化链球菌、普雷沃菌、梭杆菌、韦荣球菌、真杆菌、放线菌和二氧化碳嗜纤维等多种厌氧菌。本实施例选择具核梭杆菌为目标菌株进行相关的实验研究。菌株由南方医科大学南方医院检验科提供。
[0036] 硅橡胶是目前颌面部软组织缺损赝复的首选材料,有学者研究认为MDX4-4210双组分室温固化型硅橡胶具有比其它硅橡胶更多的优越性,所以本实验研究的目的是选择现有的性能优良的MDX4-4210硅橡胶为例,进行改性或改良,以制备出一种具有抗菌活性的载药微球硅橡胶复合材料。
[0037] 试剂:苯酰甲硝唑(adamas,瑞士);苯酰甲硝唑标准品(>99.6%,天津中安药业有限公司提供);聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA,聚乳酸/羟基乙酸=50/50,粘度0.43dl/g山东省医疗器械研究所,山东);聚乙烯醇(PVA,醇解度=87.0-89.0%,阿拉丁,上海);苯酰甲硝唑聚乳酸-羟基乙酸载药微球(自制,密度为0.68g/cm3);乙腈(HPLC级,默克,德国);其他试剂均为分析纯。
[0038] 仪器:电动磁力搅拌器(HJ-6多头磁力加热搅拌器,金坛市富华电器有限公司,中国);HPLC(LC-20AT,日本岛津);马尔文粒径测定仪(Zetasizer 3000HS/IHPL,英国);冷冻干燥机(FD-1B-50,中国);TEM(JEM-1230,日本);SEM(S-3700,日本);聚四氟乙烯模具(东莞和翔精密模具有限公司,中国)。
[0039] (1)苯酰甲硝唑PLGA载药微球的制备
[0040] 实验中采用乳化-溶剂挥发的方法制备苯酰甲硝唑聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球。将药物和PLGA置于有机溶剂丙酮中,溶解作为内油相,将内油相加入到外水相聚乙烯醇(PVA)溶液中,通过搅拌6h,挥去有机溶剂丙酮,加入冻干保护剂,混悬液(10分钟,800rpm)离心除去游离的药物。取上清液(20分钟,15000rpm)离心处理后,去上清,沉淀用去离子水洗涤,重复三次,除去残留PVA。用1ml去离子水重新分散沉淀,冷冻干燥,即得MEB-PLGA-NPs,备用。
[0041] 按照上述方法制备出白色,粉末状产物(见图1),显微镜下观察,苯酰甲硝唑PLGA载药微球形态呈圆球状,粒径分散均匀的载药微球(见图2),SEM观察微球表面光滑,形状分布良好,大小均匀的圆球状(见图3)。
[0042] (2)苯酰甲硝唑PLGA载药微球HPLC检测条件考察
[0043] 标准品的配制:精密称取称取50mg苯酰甲硝唑标准品,置于50ml溶量瓶中,用甲醇定容至刻度,即配置成1μg/ml的苯酰甲硝唑标准品储备液。
[0044] 苯酰甲硝唑HPLC最大吸收波长的确定:取苯酰甲硝唑标准品储备液,用甲醇稀释至5μg/ml的标准品溶液,采用紫外分光光度计,在200-400nm下,进行苯酰甲硝唑最大吸收波长扫描,结果表明药物在222nm和308nm处,均有最大吸收峰,222nm处的吸收度比308nm处高,且在实验中发现苯酰甲硝唑在HPLC浓度测定中在222nm处的响应值比308nm高,所以选择222nm作为药物的最大吸收波长进行药物浓度的测定。
[0045] 按照英国药典(2009)对苯酰甲硝唑的HPLC检测条件进行确定。
[0046] 最后确定的HPLC检测条件为:色谱柱:Waters Xteer C18柱(150mm×4.6mm,5μm);流动相:乙腈-磷酸二氢钾(40:60);检测波长:222nm;柱温:30OC;进样量:20μL;
流速:1ml/分钟。
[0047] 通过对空白实验样品和载药微球样品进行分析,上述HPLC条件中,样品中杂质对苯酰甲硝唑没有干扰。
[0048] 绘制线性回归方程:取适量苯酰甲硝唑储备液,用适量流动相稀释成0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、7μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml标准品溶液,按照上述HPLC条件测定各个标准品溶液的吸收峰面积,对苯酰甲硝唑浓度进行线性回归,绘制线性回归方程。
[0049] Y=1.803e-005X+0.166(R=0.9995),线性范围:0.2μg/ml-20μg/ml。检测限:0.1μg/ml。
[0050] 精密度考察:分别对0.3μg/ml,5μg/ml,10μg/ml标准品溶液进行日内精密度和日间精密度的考察。
[0051] 日内精密度:取适量苯酰甲硝唑储备液,用适量流动相稀释成0.3μg/ml,5μg/ml,10μg/ml标准品溶液各三份,按照上述HPLC条件测定吸收峰面积,分别测定5次,计算药物浓度。
[0052] 日间精密度:取适量苯酰甲硝唑储备液,用适量流动相稀释成0.3μg/ml,5μg/ml,10μg/ml标准品溶液各一份,取适量,按照上述HPLC条件测定吸收峰面积,连续测定五天,计算药物浓度。
[0053] 结果显示,各组RSD<3%,方法的精密度良好(见表1)。
[0054] 表1 MEB的日内、日间精密度(mean±SD,n=5)
[0055]
[0056] 加样回收率考察:精密称取实验制得的苯酰甲硝唑PLGA载药微球50mg,置于2ml乙腈中,溶解后,加入流动相适量,超声溶解后,流动相定容至50ml,取10ml试样,(20分钟,15000rpm)离心,取三份1ml的上清液,分别加入MEB储备液(0.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml)1ml,用流动相定容至10ml。取试样2ml,(20分钟,15000rpm)离心取上清,测定药物浓度,计算回收率。
[0057] 通过将低、中、高三个浓度的MEB储备液加入到苯酰甲硝唑PLGA样品的乙腈溶液中,进行加样回收率考察,结果显示回收率91%-106%之间,显示加样回收率结果良好(见表2)。
[0058] 表2:MEB回收率测定结果(mean±SD,n=3)
[0059]标准液(μg/ml) 加入量(μg) 测得量(μg) 回收率(%) RSD(%)
0.5 0.5 0.46±0.01 91.97±1.31 1.42
5 5 4.78±0.02 95.44±1.96 2.05
10 10 10.51±0.02 105.22±1.74 1.65
[0060] (3)苯酰甲硝唑PLGA微球制备单因素考察
[0061] 投药量对微球载药量的影响:精密称取试样,适量,丙酮溶解后,加入流动相稀释后进行药物浓度的测定,最后计算得到苯酰甲硝唑3mg,6mg,12mg,24mg,30mg的载药量分别为0.83%、0.95%、1.15%、2.27%、2.41%。包封率分别为34.03%、19.95%、12.65%、13.62%、12.05%。从结果中可以看出随着药物用量的增加,载药量也随着增加,但是当继续加大投药量时,载药量增加不明显,相反由于投药量增加,药物的包封率呈现明显的下降,因此选择
1/5、1/10、1/20的投药比进行后续实验(见表3)。
[0062] 表3 MEB用量对MEB-PLGA-NPs载药量的影响
[0063]MEB用量(mg) 载药量(%) 包封率(%) 粒径(nm) PI
3 0.83 34.03 276.4 0.321
6 0.95 19.95 221.8 0.335
12 1.15 12.65 230.2 0.280
24 2.27 13.62 289.4 0.207
30 2.41 12.05 310.2 0.374
[0064] 载体PLGA用量对微球载药量的影响:精密称取试样,适量,丙酮溶解后,加入流动相稀释后进行药物浓度的测定,最后计算得到载体PLGA30mg,60mg,120mg,240mg,300mg。载药量分别为1.03%、1.62%、2.80%、2.43%、2.42%,包封率分别为3.60%,9.72%,30.80%,
51.03%,62.92%。载体材料PLGA用量增加时,油相液滴的粘度强度增大,对搅拌剪切力的耐受力也增强,在相同的外界能量输入时,乳化形成的液滴不会被重新分散,同时,液滴的粒径也相应增大,最终形成粒径较大,载药量较高的载药微球,但是载体材料PLGA的浓度过高,会影响PLGA和药物在有机溶剂中的溶解性,而当PLGA用量过低时,制得的载药微球载药量过低并且产率也过低,因此,选用60mg、120mg、240mg的载体材料PLGA进行后续实验(见表4)。
[0065] 表4 PLGA用量对MEB-PLGA-NPs载药量的影响
[0066]PLGA用量(mg) 载药量(%) 包封率(%) 粒径(nm) PI
30 1.03 3.60 265.8 0.265
60 1.62 9.72 278.1 0.247
120 2.80 30.80 312.6 0.312
240 2.43 51.03 343.5 0.309
300 2.42 62.92 335.2 0.293
[0067] 油/水比对微球载药量的影响:精密称取试样,适量,丙酮溶解后,加入流动相稀释后进行药物浓度的测定,最后计算得到6ml,12ml,24ml,48ml,96ml的1%的PVA溶液组的载药量分别为1.01%、1.61%、2.57%、2.80%、3.21%,包封率分别为11.11%,17.71%,28.27%,30.80%,35.31%。在高比例的油水相时,体系中不能形成稳定的乳液,并且有机溶剂丙酮极易挥发,影响制剂的形成,降低苯酰甲硝唑聚乳酸-羟基乙酸载药微球的载药量;在低比例的油水相时,体系中总的表面活性剂较多,有利于提高乳液的稳定性,提高了苯酰甲硝唑的载药量。但是低比例的油/水时,内油相加入到外水相时迅速析出,影响制剂的制成;而高比例的油/水时,影响后续的离心、洗涤的效果,因此本实验中选择1/2、1/4、1/8的油/水进行后续实验(见表5)。
[0068] 表5油相与水相比例对MEB-PLGA-NPs载药量的影响
[0069]油相与水相比例 载药量(%) 包封率(%) 粒径(nm) PI
1/1 1.01 11.11 321.4 0.342
1/2 1.61 17.71 278.5 0.413
1/4 2.57 28.27 296.3 0.156
1/8 2.80 30.80 313.6 0.208
1/12 3.21 35.31 310.8 0.232
[0070] 外水相的PVA的浓度对微球载药量的影响:精密称取试样,适量,丙酮溶解后,加入流动相稀释后进行药物浓度的测定,最后计算得到0.5%,1%,2%,3%,4%PVA溶液中,载药量分别为0.65%、1.02%、1.23%、1.57%、1.84,包封率分别为7.15%、11.22%、13.53%、17.27%、20.24%,结果显示随着PVA浓度地增加,载药量和包封率均呈增加地趋势,可能是因为随着PVA浓度的增加,油相和水相之间能够形成稳定性更好的体系有关,但是随着PVA浓度的增加,在离心洗涤中,操作效率低下,因此在后续实验中选择1%,2%,3%的PVA浓度进行考察(见表6)。
[0071] 表6 PVA浓度对MEB-PLGA-NPs载药量的影响
[0072]PVA浓度(%) 载药量(%) 包封率(%) 粒径(nm) PI
0.5 0.65 7.15 242.4 0.287
1 1.02 11.22 314.6 0.265
2 1.23 13.53 295.4 0.371
3 1.57 17.27 224.3 0.319
4 1.84 20.24 245.7 0.216
[0073] 搅拌速度对微球载药量的影响:精密称取试样,适量,丙酮溶解后,加入流动相稀释后进行药物浓度的测定,最后计算得到300rpm,400rpm,500rpm组,载药量分别为0.91%、0.95%、0.94%,包封率分别为10.01%,10.45%,10.34%,结果显示搅拌速度对微球制剂的载药量和包封率影响不明显,因此在后续实验中不对搅拌速度进行考察,以300rpm进行进一步研究(见表7)。
[0074] 表7搅拌速度对MEB-PLGA-NPs载药量的影响
[0075]搅拌速度(rpm) 载药量(%) 包封率(%) 粒径(nm) PI
300 0.91 10.01 321.5 0.327
400 0.95 10.45 306.8 0.331
500 0.94 10.34 294.2 0.216
[0076] 正交设计:在单因素考察基础上,选择了影响MEB-PLGA-NPs载药量的4个主要因4
素的3个水平,进行L9(3)正交实验考察。4个因素分别是:MEB与PLGA比(A),PLGA用量(B)、油相与水相比例(C)、外水相PVA浓度(D)。正交实验结果如表8所示。以载药量为指标,通过对正交实验结果进行极差分析得出对微球质量影响程度的顺序为:载体PLGA浓度>油/水>投药比>PVA浓度,即B>D>A>C。综合分析,本实验确定的最佳处方为A2B3C2D1即:MEB为24mg,PLGA用量为240mg,油相与水相比例为1/4,PVA浓度为1%。
[0077] 按照最优工艺制备三批样品,实验测得的平均载药量为3.59±0.15%,平均包封率为39.52±1.65%,平均粒径为312.03±12.77nm,粒径大小呈正态分布,多分散系数范围为0.12~0.21。
[0078] 表8苯酰甲硝唑PLGA载药微球正交实验结果(mean±SD,n=3)
[0079]实验序号 A B C D 载药量 包封率 粒径(nm)
1 1 1 1 1 1.32±0.81 7.96±4.86 228.70±3.96
2 1 2 2 2 1.49±0.32 8.98±1.95 260.97±8.28
3 1 3 3 3 1.84±0.56 11.02±3.37 375.90±8.58
4 2 1 2 3 0.91±0.20 10.05±2.21 224.87±14.26
5 2 2 3 1 2.17±0.77 23.87±8.49 276.67±9.59
6 2 3 1 2 2.38±0.80 26.16±0.87 261.93±3.24
7 3 1 3 2 0.72±0.12 15.07±0.49 234.83±16.88
8 3 2 1 3 0.81±0.04 16.94±0.82 259.33±3.26
9 3 3 2 1 2.85±0.34 59.83±7.17 277.47±14.38
K1 1.55 0.98 1.50 2.11
K2 1.82 1.49 1.75 1.53
K3 1.46 2.36 1.58 1.19
R 0.36 1.38 0.25 0.92
[0080] (4)苯酰甲硝唑硅橡胶复合材料的制备
[0081] 通过对实验条件进行考察,最后确定的制备工艺为:硅橡胶基胶与稀释剂搅拌均匀后,加入苯酰甲硝唑PLGA微球,继续搅拌30分钟,加入MDX4-4210硅橡胶的固化剂,继续搅拌10分钟(转速800rpm);随后将混合体系进行预抽真空10分钟,然后体系倒入聚四氟乙烯模具,再次抽真空10分钟。然后将模具于25℃静置4小时以使稀释剂缓慢挥发,避免气泡产生。再将模具放入60℃烘箱加速固化2小时。将固化后的硅橡胶从模具中取出备用。
[0082] 用天平称取10.0g MDX-4210硅橡胶基质,用Q7-9180硅油稀释剂稀释,在室温下通过磁力搅拌10分钟(转速300rpm)将MDX4-4210硅橡胶的基质;加入不同比例的苯酰甲硝唑和载药微球,磁力搅拌10分钟(转速300rpm)混合均匀后,将MDX4-4210硅橡胶的固化剂(1g)加入到混体系中继续搅拌10分钟(转速800rpm)。随后将混合物体系倒入聚四氟乙烯模具中,抽真空30分钟。然后将模具于25℃静置4小时以使稀释剂缓慢挥发,避免产生气泡。再将模具放入60℃烘箱中加速固化2小时。将固化后的硅橡胶从模具中取出,用于以下的性能实验。
[0083] (5)苯酰甲硝唑硅橡胶复合材料的表征
[0084] 制备得到的复合材料表面平整光滑,没有残留气泡(见图4、图5)随着投药量的增加,体系透明度逐渐下降。
[0085] 取适量苯酰甲硝唑硅橡胶复合材料,于液氮中萃断,断面喷金处理,进行扫描电镜(SEM)观察苯酰甲硝唑及其载药微球制剂在硅橡胶中的分布情况。结果显示随着投药量增加,药物颗粒(载药微球)也随着增多(见图6)。
[0086] (6)苯酰甲硝唑硅橡胶复合材料中药物含量的测定
[0087] 分别取三批相比含量的各组苯酰甲硝唑硅橡胶复合材料,剪碎后,各取3g试样,精密称定后,置于50ml容量瓶中,加入乙腈20ml,超声处理2h,加入流动相定容至刻度,备用。取1ml超声提取液,离心(20分钟,15000rpm)处理后,取上清,用0.45μm的微孔滤膜过滤,即得供试品溶液,HPLC测定供试品中的药物浓度。HPLC检测条件:色谱柱:150mm×4.6,5μm;柱温30℃;流动相:乙腈-25mmol/L磷酸二氢钾(40:60);检测波长:222nm;流速1ml/分钟;进样量20μl。
[0088] 结果表明,各组中含药量接近于标示量SD<10%(见表9);同时取适量的释放介质,加入等量的标准品溶液对方法进行加样回收率考察,结果显示该方法可靠SD<5%(见表9)。
[0089] 表9苯酰甲硝唑硅橡胶复合材料药物含量考察(mean±SD)
[0090]组别 样本量 含药量(mg) 占标示量(%) 回收率(%)
空白 3 0 0 98.35±4.32
0.2%MEB 3 6.21±0.06 103.41±6.52 100.64±3.57
0.4%MEB 3 12.03±0.07 102.76±5.26 103.71±2.42
0.8%MEB 3 23.58±0.06 98.27±8.22 99.70±3.54
[0091]1.2%MEB 3 35.87±0.08 99.63±7.58 101.46±2.61
10%MEB-PLGA-NPs 3 10.93±0.13 101.45±8.37 101.76±2.73
20%MEB-PLGA-NPs 3 21.04±0.11 97.67±8.65 100.92±2.87
30%MEB-PLGA-NPs 3 31.86±0.31 98.61±7.46 99.32±3.59
[0092] (7)苯酰甲硝唑硅橡胶复合材料体外释放考察
[0093] 取1.2%苯酰甲硝唑(或30%苯酰甲硝唑PLGA载药微球)硅橡胶复合材料3g,精密称定,置于(含有1%的十二烷基硫酸钠)200ml PBS(pH=7.0)的溶出瓶中,37±1℃,120rpm恒速搅拌,在设定的时间间隔点取样2ml,同时补加新鲜同温等体积PBS,样品离心(10分钟,15000rpm)处理后,取上清液,用0.45μm的微孔滤膜过滤,即得供试品溶液。按照上述的HPLC测定方法,检测释放介质中的药物含量,计算苯酰甲硝唑的累积释放度。
[0094] 结果表明,复合材料中药物的释放要比裸药慢得多,在考察的480h内,药物累积释放度为17.18±1.43%,MEB-PLGA-NPs组为37.66±1.79%、MEB-SE组为35.09%,提示硅橡胶可以作为苯酰甲硝唑的载体材料进行缓释材料的制备(见图7)。
[0095] (8)苯酰甲硝唑硅橡胶复合材料机械性能考察
[0096] 赝复体在使用过程中,长期受到各个方向的拉伸应力,足够的拉伸强度可以使赝复体对抗拉伸应力,延长使用寿命。拉伸强度是指材料产生最大均匀塑性变形的应力。
[0097] 赝复体在制作和使用过程中,都不可避免地受到各个方向上的作用力而产生撕裂,尤其是赝复体薄弱边缘。足够的撕裂强度将帮助赝复体抵抗这些撕裂作用力,延长其使用寿命。
[0098] 拉伸和撕裂性能测试分别参照标准ISO37:2005和ISO34-1:2004使用万能测试仪(3365,INSTRON)测试,横梁速度500mm/分钟,按照图8和图9制备相应试样。
[0099] 拉伸强度测试结果如表10所示。未填充苯酰甲硝唑(或苯酰甲硝唑PLGA载药微球)的空白硅橡胶,拉伸强度为23.45MPa。加入0.2%、0.4%、0.8%和1.2%的苯酰甲硝唑后,拉伸强度为22.15MPa(P=1.000)、20.00MPa(P=0.422)、20.38MPa(P=0.886)和20.08MPa(P=0.047)。加入10%、20%和30%苯酰甲硝唑PLGA载药微球后,拉伸强度为
18.20MPa(P=0.026)、20.93MPa(P=0.034)和15.00MPa(P=0.022)。实验结果显示,硅橡胶中加入填充物后,随着填充量的加大,硅橡胶的撕裂强度呈现下降的趋势,当填充量达到1.2%以上时,实验组与空白组相比,具有显著性差异(P<0.05)。
[0100] 表10苯酰甲硝唑橡胶复合材料拉伸性能测试结果(mean±SD)
[0101]
[0102] 注:MEB组:苯酰甲硝唑组;MEB-PLGA-NPs组:苯酰甲硝唑载药微球组
[0103] *与空白硅橡胶组对照,P<0.05
[0104] 拉断伸长率测试结果如表11所示。未填充苯酰甲硝唑(或苯酰甲硝唑PLGA载药微球)的空白硅橡胶,拉断伸长率为112.44%。加入0.2%、0.4%、0.8%和1.2%的苯酰甲硝唑后,拉断伸长率为124.75%(P=0.906)、111.62%(P=0.998)、116.38%(P=0.861)和127.91%(P=0.690)。加入10%、20%和30%苯酰甲硝唑PLGA载药微球后,拉断伸长率为
109.13%(P=0.510)、121.63%(P=0.327)和104.12%(P=0.919)。各实验组的拉断伸长率与空白组相比,无显著性差异(P>0.05)。
[0105] 表11苯酰甲硝唑橡胶复合材料拉伸性能测试结果(mean±SD)
[0106]
[0107]
[0108] 注:MEB组:苯酰甲硝唑组;MEB-PLGA-NPs组:苯酰甲硝唑载药微球组
[0109] *与空白硅橡胶组对照,P>0.05
[0110] 撕裂强度测试结果如表12所示。未填充苯酰甲硝唑(或苯酰甲硝唑PLGA载药微球)的空白硅橡胶,撕裂强度为24.70kN/M。加入0.2%、0.4%、0.8%和1.2%的苯酰甲硝唑后,撕裂强度为20.72kN/M(P=0.791)、20.08kN/M(P=0.183)、19.82kN/M(P=0.399)和20.02kN/M(P=0.195)。加入10%、20%和30%苯酰甲硝唑PLGA载药微球后,撕裂强度为18.60kN/M(P=0.084)、11.83kN/M(P=0.032)和9.25kN/M(P=0.007)。实验结果显示,随着填充量的加大,硅橡胶的撕裂强度呈现下降的趋势,当填充量达到20%时,实验组与空白组相比,具有显著性差异(P<0.05)。
[0111] 表12苯酰甲硝唑橡胶复合材料撕裂性能测试结果(mean±SD)
[0112]
[0113] 注:MEB组:苯酰甲硝唑组;MEB-PLGA-NPs组:苯酰甲硝唑载药微球组
[0114] *与空白硅橡胶组对照,P<0.05
[0115] 硅橡胶的柔软度及弹性对患者的舒适度有直接影响,所以,实验中对制备的复合材料进行了邵氏硬度的考察,参照标准为ISO7619-1:2004用邵A硬度计(LX-A,SHENGSHEN)测试。每种混合物至少测试三个样品(30mm×30mm×6mm(见图10),在试样表面不同位置进行5次测量取中值。不同测量位置两两间距至少6mm,距任一边缘至少12mm。
[0116] 邵氏硬度测试结果如表13所示。未填充苯酰甲硝唑(或苯酰甲硝唑PLGA载药微球)的空白硅橡胶,邵氏A硬度为22.25。加入0.2%、0.4%、0.8%和1.2%的苯酰甲硝唑后,邵氏A硬度为25.75(P=0.071)、25.50(P=0.040)、26.50(P=0.034)和26.75(P=0.040)。加入10%、20%和30%苯酰甲硝唑PLGA载药微球后,邵氏A硬度为29.38(P=0.004)、
31.25(P=0.030)和33.12(P=0.045)。实验结果显示,硅橡胶中加入填充物后,各实验组的邵氏硬度呈逐渐增加的趋势,与空白硅橡胶组相比,各组都有显著性差异,(P<0.05)。
[0117] 表13苯酰甲硝唑橡胶复合材料邵氏A硬度(mean±SD)
[0118]
[0119] 注:MEB组:苯酰甲硝唑组;MEB-PLGA-NPs组:苯酰甲硝唑载药微球组
[0120] *与空白硅橡胶组对照,P<0.05
[0121] 硅橡胶自身具有重量大、固位性差的缺点,本研究中,将目标药物制备成载药微球,以期利用载药微球的立体空间大、密度小的特点对硅橡胶改性,降低硅橡胶密度,减轻硅橡胶的重量,提高临床应用时的固位性。
[0122] 按照GB9891-88,测定苯酰甲硝唑硅橡胶复合材料的密度。称取重量为3g的各组硅橡胶试样,精密称定后,备用。装有5ml去离子水量筒的质量(M1),然后将试样放入量筒中再次称定总质量(M2),同时读取试样排出液体的体积V,利用阿基米德原理计算即得苯酰甲硝唑硅橡胶复合材料的密度。
[0123] 密度测试结果如表14所示,未填充苯酰甲硝唑(或苯酰甲硝唑PLGA载药微球)3
的空白硅橡胶,密度为1.363g/cm。加入0.2%、0.4%、0.8%和1.2%的苯酰甲硝唑后,密度
3 3 3
分 别 为 1.363g/cm(P=0.992)、1.362g/cm(P=0.987)、1.360g/cm(P=0.972) 和 1.357g/
3
cm(P=0.941),与空白硅橡胶相比,没有显著性差异。加入10%、20%、30%苯酰甲硝唑
3 3
PLGA载药微球后,密度分别为1.252g/cm(P=0.208)、1.085g/cm(P=0.005)和0.967g/
3
cm(P=0.001),与空白硅橡胶相比,具有显著性差异。本实验结果显示,随着填充量的增加,硅橡胶的密度下降越明显,当填充苯酰甲硝唑载药微球时,密度降低效果更显著。
[0124] 表14苯酰甲硝唑橡胶复合材料密度测试结果(mean±SD)
[0125]
[0126] 注:MEB组:苯酰甲硝唑组;MEB-PLGA-NPs组:苯酰甲硝唑载药微球组
[0127] *与空白硅橡胶组对照,P<0.05
[0128] (9)苯酰甲硝唑硅橡胶复合材料抗菌效果考察
[0129] 将苯酰甲硝唑硅橡胶制成直径6mm药敏片,灭菌后,分别贴敷于涂布比浊度为0.5具核梭杆菌的BHI血培养皿上,然后放入厌氧罐中,在35±1℃烘箱中进行无氧培养48h,测量抑菌环大小,观察抑菌效果。
[0130] 苯酰甲硝唑硅橡胶复合材料对具核梭杆菌的药敏实验结果显示,实验制得的各组苯酰甲硝唑硅橡胶复合材料对ATCC10953具有一定的抗菌活性,且随着苯酰甲硝唑填充量的增加,抗菌活性呈增强的趋势;苯酰甲硝唑PLGA载药微球组,对ATCC10953具有一定的抗菌活性,且随着苯酰甲硝唑聚乳酸-羟基乙酸载药微球填充量的增加,抗菌活性也呈现增强的趋势(见图11、图12和表15)。各组的抑菌环直径分别为:空白硅橡胶组为0mm、0.2%MEB硅橡胶组为12.93±0.50mm、0.4%MEB硅橡胶组为19.87±1.53mm、0.8%MEB硅橡胶组为25.00±0.60mm、1.2%MEB硅橡胶组为34.27±0.30mm和10%MEB-PLGA-NPs硅橡胶组为
12.33±1.15mm、20%MEB-PLGA-NPs硅橡胶组为21.26±0.21mm、30%MEB-PLGA-NPs硅橡胶组
22.10±0.17mm。
[0131] 表15苯酰甲硝唑硅橡胶复合材料对具核梭杆菌ATCC10953抗菌活性(mean±SD)[0132]
[0133] MEB组:苯酰甲硝唑硅橡胶复合材料组;MEB-NPs组:苯酰甲硝唑硅橡胶复合材料组
[0134] *所有组间比较P<0.05
[0135] (10)苯酰甲硝唑PLGA载药微球硅橡胶复合材料生物安全评价
[0136] 实验中采取MTT实验的方法进行复合材料生物安全考察。培养小鼠成纤维细胞ATCC NIH3T3)直至达到对数生长期,细胞趋于融合。用0.25%胰酶消化分散细胞。用生长培养液配置成4.0×104/mL细胞悬液,取100μl加入到96孔中(四周填充PBS缓冲液),培养24h,待细胞贴壁生长后,换成100μl的空白硅橡胶样品、1.2%MEB硅橡胶样品、30%MEB-PLGA-NPs-SE的浸提液,继续培养48h,加入20μl MTT溶液(5mg/ml),培养4h后,去除培养液,加入100μl的DMSO,震荡10分钟后,在570nm处测定吸收度。
[0137] 实验中通过测定OD570,考察硅橡胶试样的细胞毒性,将各实验组的OD570值减去空白对照组的OD570值进行校正后,计算细胞相对增殖率,并采用美国药典的“生物材料的生物安全分级”标准进行分类,由表16、表17和表18可见,实验中制备的硅橡胶复合材料生物安全良好。
[0138] 表16苯酰甲硝唑硅橡胶复合材料细胞毒性实验OD570值(mean±SD,n=4)
[0139]
[0140]
[0141] 注:A:阴性对照组;B:空白硅橡胶组;C:1.2%苯酰甲硝唑硅橡胶复合材料组;D:30%苯酰甲硝唑PLGA载药微球硅橡胶复合材料组;E:阳性组
[0142] 表17苯酰甲硝唑硅橡胶复合材料细胞相对增殖率
[0143]
[0144] 注:A:阴性对照组;B:空白硅橡胶组;C:1.2%苯酰甲硝唑硅橡胶复合材料组;D:30%苯酰甲硝唑PLGA载药微球硅橡胶复合材料组;E:阳性组
[0145] 表18苯酰甲硝唑硅橡胶复合材料细胞毒性分级
[0146]
[0147] 注:A:阴性对照组;B:空白硅橡胶组;C:1.2%苯酰甲硝唑硅橡胶复合材料组;D:30%苯酰甲硝唑PLGA载药微球硅橡胶复合材料组;E:阳性组
[0148] 实施例二:头孢呋辛钠载药微球硅橡胶复合材料的制备与性能评价
[0149] 本实施例选择头孢呋辛钠为抗菌药物,制备成头孢呋辛钠载药微球硅橡胶复合材料,然后对该载药微球硅橡胶复合材料的抗菌活性、生物安全等进行初步评价,取得了与苯酰甲硝唑载药微球硅橡胶复合材料类似的性能数据。
[0150] 药物的选择:金黄色葡萄球菌是引发口腔颌面修复手术后感染的常见细菌之一。头孢呋辛钠为第二代头孢菌素类抗生素,在1~2mg/L的浓度下可分别抑制对青霉素敏感和耐药的全部金黄色葡萄球菌。因此,本实施例选用头孢呋辛钠作为模型药物,制备成头孢呋辛钠硅橡胶复合材料。
[0151] 本实施例选择金黄色葡萄球菌为目标菌株进行相关的实验研究。菌株由南方医科大学南方医院检验科提供。
[0152] 试剂:头孢呋辛钠(ACS Dobfar S.P.A,纯度96%,意大利);聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA,聚乳酸/羟基乙酸=50/50,粘度0.43dl/g山东省医疗器械研究所,山东);聚乙烯醇(PVA,醇解度=87.0-89.0%,阿拉丁,上海);乙腈(HPLC级,默克,德国);其他试剂均为分析纯。
[0153] 仪器:电动磁力搅拌器(HJ-6多头磁力加热搅拌器,金坛市富华电器有限公司,中国);HPLC(LC-20AT,日本岛津);马尔文粒径测定仪(Zetasizer3000HS/IHPL,英国);冷冻干燥机(FD-1B-50,中国);TEM(JEM-1230,日本);SEM(S-3700,日本);聚四氟乙烯模具(东莞和翔精密模具有限公司,中国)。
[0154] (1)头孢呋辛钠PLGA载药微球的制备与HPLC检测条件考察
[0155] 最佳制备工艺为:采用复乳法制备头孢呋辛钠PLGA载药微球。在单因素考察的基础上,选择对载药微球载药量影响较大的药物用量,载体材料(PLGA)用量,内水相表面活性剂的浓度,外水相的体积进行正交设计考察。通过对载药量进行极差分析,显示各因素对微球载药量的影响结果:药物用量>外水相的体积>内水相中的表面活性剂的浓度>载体用量,综合分析得到最优的处方工艺:药物用量75mg,载体材料PLGA用量为100mg,内水相中的表面活性剂PVA的浓度为2%,外水相的体积为200ml。
[0156] (2)头孢呋辛钠硅橡胶复合材料的制备
[0157] 用天平称取10.0g MDX-4210硅橡胶基质,用Q7-9180硅油稀释剂稀释,在室温下通过磁力搅拌10分钟(转速300rpm)将MDX4-4210硅橡胶的基质;加入不同比例的载药微球,磁力搅拌10分钟(转速300rpm)混合均匀后,将MDX4-4210硅橡胶的固化剂(1g)加入到混体系中继续搅拌10分钟(转速800rpm)。随后将混合物体系倒入聚四氟乙烯模具中,抽真空30分钟。然后将模具于25℃静置4小时以使稀释剂缓慢挥发,避免产生气泡。再将模具放入60℃烘箱中加速固化2小时。将固化后的硅橡胶从模具中取出,用于以下的性能实验。
[0158] (3)头孢呋辛钠硅橡胶复合材料的表观考察
[0159] 取适量头孢呋辛钠硅橡胶复合材料,于液氮中萃断,断面喷金处理,在扫描电镜(SEM)下观察头孢呋辛钠及其制剂在硅橡胶中的分布情况。
[0160] 制备得到的复合材料表面平整光滑,没有残留气泡,随着投药量的增加,体系透明度逐渐下降;扫描电镜(SEM)分析得到随着投药量增加,药物颗粒也随着增多。
[0161] (4)头孢呋辛钠硅橡胶复合材料中药物含量的测定
[0162] 分别取三批相比含量的各组头孢呋辛钠硅橡胶复合材料,剪碎后,各取3g试样,精密称定后,置于50ml容量瓶中,加入乙腈,超声处理0.5h,加入去离子水定容至刻度,反复进行三次,定容到250ml容量瓶,备用。取1ml超声浸提溶液,15000rpm离心10分钟,0.45μm的微孔滤膜过滤后,进行HPLC测定样品浓度。HPLC检测条件:色谱柱:150mm×4.6,5μm;柱温30℃;流动相:乙腈-0.68g/L乙酸钠pH=3.5(15:85);检测波长:
274nm;流速1ml/分钟;进样量20μl。
[0163] 结果表明,各组中含药量接近于标示量;同时取适量的释放介质,加入等量的标准品溶液对方法进行加样回收率考察,结果显示该方法可靠。
[0164] 分别取三批相比含量的各组头孢呋辛钠硅橡胶复合材料,剪碎后,置于50ml容量瓶中,加入乙腈20ml,超声提取0.5h,加入去离子水定容至刻度,反复进行三次,定容到250ml容量瓶,备用。取1ml超声浸提溶液,15000rpm离心10分钟,取上清,用0.45μm的微孔滤膜过滤,即得供试品溶液,HPLC测定供试品中的药物浓度。HPLC检测条件:色谱柱:
150mm×4.6,5μm;柱温30℃;流动相:乙腈-0.68g/L乙酸钠pH=3.5(15:85);检测波长:
274nm;流速1ml/分钟;进样量20μl。
[0165] 结果表明,各组中含药量接近于标示量SD<10%;同时取适量的释放介质,加入等量的标准品溶液对方法进行加样回收率考察,结果显示该方法可靠SD<5%。
[0166] (5)头孢呋辛钠硅橡胶复合材料体外释放考察
[0167] 称取头孢呋辛钠硅橡胶复合材料适量,精密称定后,置于100ml PBS(pH=7.0)溶液中,恒定于37±1℃、100rpm条件下振荡考察,分别于0.5,1,2,3,4,5,6,10,24,48,72,96,120,168,240,480h取样1ml,15000rpm离心10分钟,0.45μm的微孔滤膜过滤后,进行HPLC测定样品浓度。
[0168] 结果表明,复合材料中药物的释放要比裸药慢得多,在考察的480h内,药物释放34%,而裸药组在考察的24h内释放38%,提示硅橡胶可以作为头孢呋辛钠的载体材料进行缓释材料的制备。MEB-PLGA-NPs组为37.66±1.79%、MEB-SE组为35.09±2.03%。
[0169] 而且,微球本身也具有一定的缓释功能,这样,硅橡胶基质结合微球可以更好地实现药物缓释及远期的可控释放。
[0170] (6)头孢呋辛钠硅橡胶复合材料机械性能考察
[0171] 赝复体在使用过程中,长期受到各个方向的拉伸应力,足够的拉伸强度可以使赝复体对抗拉伸应力,延长使用寿命。拉伸强度是指材料产生最大均匀塑性变形的应力。
[0172] 赝复体在制作和使用过程中,都不可避免地受到各个方向上的作用力而产生撕裂,尤其是赝复体薄弱边缘。足够的撕裂强度将帮助赝复体抵抗这些撕裂作用力,延长其使用寿命。
[0173] 拉伸和撕裂性能测试分别参照标准ISO37:2005和ISO34-1:2004使用万能测试仪(3365,INSTRON)测试,横梁速度500mm/分钟,按照图4和图5制备相应试样。
[0174] 硅橡胶的柔软度及弹性对患者的舒适度有直接影响,所以,实验中对制备的复合材料进行了邵氏硬度的考察,参照标准为ISO7619-1:2004用邵A硬度计(LX-A,SHENGSHEN)测试。每种混合物至少测试三个样品(30mm×30mm×6mm,在试样表面不同位置进行5次测量取中值。不同测量位置两两间距至少6mm,距任一边缘至少12mm。
[0175] 实验结果表明,与空白硅橡胶相比,在实验各组中的复合材料对硅橡胶的邵氏硬度、密度影响显著,随着填充量的增加,邵氏硬度呈逐渐增加的趋势,而硅橡胶复合材料的密度则随着填充量的增加而不断降低;头孢呋辛钠PLGA载药微球填充物的加入对硅橡胶拉伸强度、拉断伸长率、撕裂强度影响较小。
[0176] (7)头孢呋辛钠硅橡胶复合材料抗菌效果考察
[0177] 将头孢呋辛钠硅橡胶复合材料制成直径6mm药敏片,灭菌后,分别贴敷于涂布比浊度为0.5的金黄色葡萄球菌(ATCC25923)的BHI血培养皿上,然后放入厌氧罐中,在35℃烘箱中进行无氧培养48h,测量抑菌环大小,观察抑菌效果。
[0178] 头孢呋辛钠硅橡胶复合材料对金黄色葡萄球菌的药敏结果显示,复合材料对金黄色葡萄球菌具有一定的抗菌活性,随着投药量的增加,抗菌活性越强,这与药物的体外释放结果吻合。
[0179] (8)头孢呋辛钠PLGA载药微球硅橡胶复合材料生物安全评价
[0180] 实验中采取MTT实验的方法进行复合材料生物安全考察。培养小鼠成纤维细胞ATCC NIH3T3)直至达到对数生长期,细胞趋于融合。用0.25%胰酶消化分散细胞。用生长4
培养液配置成4.0×10/mL细胞悬液,取100μl加入到96孔中(四周填充PBS缓冲液),培养24h,待细胞贴壁生长后,换成100μl的头孢呋辛钠硅橡胶(4%)和头孢呋辛钠PLGA载药微球(12%)的培养基浸提液,继续培养48h,加入20μl MTT溶液(5mg/ml),培养4h后,去除培养液,加入100μl的DMSO,震荡10分钟后,在570nm处测定吸收度。
[0181] 结果表明,头孢呋辛钠PLGA载药微球硅橡胶复合材料的生物安全较好。
[0182] 以上具体实施例是针对具核梭杆菌(厌氧)、金黄色葡萄球菌(需氧/兼性厌氧)所制备的抗菌的载药微球硅橡胶复合材料,本领域技术人员可以根据相同的原理和方法而实施于其他常见的需氧菌,例如链球菌群、罗氏菌属(微需氧)、奈瑟菌属、莫拉菌属、黏性放线菌(微需氧)、弯曲菌属(微需氧)等等;也可以根据相同的原理和方法而实施于其他常见的厌氧菌,例如变异链球菌群(微需氧/兼性厌氧)、乳杆菌属(微需氧/兼性厌氧)、梭杆菌属(绝对厌氧)、卟啉单胞菌属(绝对厌氧)、肺炎链球菌(兼性厌氧)、韦荣菌属(绝对厌氧)、棒杆菌属(兼性厌氧/厌氧)、丙酸杆菌属(厌氧到耐氧)、衣氏放线菌(兼性/绝对厌氧)、内氏放线菌(微需氧/兼性厌氧)、溶牙放线菌(微需氧/绝对厌氧)、梭菌属(少数菌种耐氧)、真杆菌属(绝对厌氧)、拟杆菌属(绝对厌氧)、聚集杆菌属(需氧/兼性厌氧)、二氧化碳噬纤维菌属(兼性厌氧)、纤毛菌属(初代绝对厌氧,次代微需氧)、沃廉菌属(绝对厌氧)、新月形单胞菌属(绝对厌氧)。

抗菌的载药微球硅橡胶复合材料委托购买说明

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抗菌的载药微球硅橡胶复合材料购买流程说明

发起委托,需要先支付100元预付款,委托不成功,全额退返预付款;

平台收到需求后,会在第一时间联系您,给到您最佳购买方案;

您在确认购买方案后,需支付全额专利购买费,预付款可抵扣购买费,专利购买费具体参见下方表格;

平台确认收款后,将帮您办理专利购买、专利过户等全流程手续;

平台代购专利失败,将全额退返专利购买费,包括预付款;

抗菌的载药微球硅橡胶复合材料专利购买费用

授权未缴费=专利裸价+著录项变更(200元)+登办费(当年年费+5元印花税)+恢复权利请求费1000元(按实收)+委托服务费(200元)+税金(专利裸价+委托服务费)x6%

已下证=专利裸价+著录项变更(200元)+滞纳金(按实收)+恢复权利请求费1000元(按实收)+委托服务费(200元)+税金(专利裸价+委托服务费)x6%

抗菌的载药微球硅橡胶复合材料购买费用说明

专利转让费用

专利买卖交易资料

Q:办理专利转让的流程及所需资料

A:专利权人变更需要办理著录项目变更手续,有代理机构的,变更手续应当由代理机构办理。

1:专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2:按规定缴纳著录项目变更手续费。

3:同时提交相关证明文件原件。

4:专利权转移的,变更后的专利权人委托新专利代理机构的,应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。更多

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A:(1)直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,(2)通过代办处缴纳,(3)通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q:专利转让变更,最快多久能出结果

A:著录项目变更请求书递交后,一般1-2个月左右就会收到通知,国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。

更多专利转让常见问题

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